CRISPR
この項目では、原核生物の抗ウイルス システムについて説明しています。遺伝子の編集での使用については、 CRISPR 遺伝子編集を参照してください
CRISPR ( / ˈ k r ɪ s p ər / ) ( clustered regular interspaced short palindromic repeatsの頭字語) は、細菌や古細菌などの原核生物のゲノムに見られるDNA配列のファミリーです。これらの配列は、バクテリオファージの DNA 断片に由来します。以前に原核生物に感染した。それらは、その後の感染時に同様のバクテリオファージから DNA を検出して破壊するために使用されます。したがって、これらの配列は、原核生物の抗ウイルス（すなわち、抗ファージ）防御システムにおいて重要な役割を果たし、獲得免疫の形態を提供します 。 CRISPR は、配列決定された細菌ゲノムの約 50% と、配列決定された古細菌のほぼ 90% に見られます。
カスケード (抗ウイルス防御のための CRISPR 関連複合体)
CRISPR RNA (緑) およびファージ DNA (赤) に結合した CRISPR Cascade タンパク質 (シアン) 識別子 生命体
大腸菌
シンボル
クリスパーPDB QYZ
CRISPR 原核生物の抗ウイルス防御メカニズムの図
Cas9 (または「CRISPR 関連タンパク質 9」) は、CRISPR 配列に相補的な特定の DNA 鎖を認識して切断するためのガイドとして CRISPR 配列を使用する酵素です。Cas9 酵素と CRISPR 配列は、生物内の遺伝子編集に使用できるCRISPR-Cas9として知られる技術の基礎を形成します。 この編集プロセスには、生物学の基礎研究、バイオテクノロジー製品の開発、病気の治療など、さまざまな用途が CRISPR-Cas9 ゲノム編集技術の開発は、エマニュエル シャルパンティエとジェニファー ダウドナに授与された 2020 年のノーベル化学賞によって認められました。
コンテンツ
1 歴史
1.1 繰り返されるシーケンス 1.2 CRISPR 関連システム 1.3 Cas9 1.4 Cas12a 1.5 Cas13
2 遺伝子座の構造
2.1 リピートとスペーサー 2.2 CRISPR RNA 構造 2.3 Cas遺伝子とCRISPRサブタイプ
3 機構
3.1 スペーサー取得
3.1.1 プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM)
3.1.2 挿入バリアント
3.2 生合成 3.3 干渉
4 進化
4.1 共進化 4.2 料金
5 身元
6 ファージによる使用
7 アプリケーション
7.1 CRISPR遺伝子編集 7.2 診断ツールとしての CRISPR
8 こちらもご覧ください
9 ノート
10 参考文献
11 参考文献
12 外部リンク
歴史
繰り返されるシーケンス
クラスタ化された DNA リピートの発見は、世界の 3 つの地域で独立して行われました。後に CRISPR と呼ばれるものの最初の記述は、1987 年に大阪大学の研究者である石野義純と彼の同僚によるものです。彼らは、大腸菌のゲノムから「 iap」遺伝子 (アルカリホスファターゼのアイソザイム変換)とともに CRISPR 配列の一部を誤ってクローニングしました。大腸菌 が標的でした。繰り返しの構成は珍しいものでした。反復シーケンスは通常、散在する異なるシーケンスなしで連続して配置されます。 彼らは中断されたクラスタ化された反復の機能を知りませんでした.
1993 年、オランダの結核菌の研究者は、その細菌の中断された直接反復(DR)のクラスターに関する 2 つの記事を発表しました。彼らは、結核菌の異なる株間で直接反復に介入する配列の多様性を認識し 、この特性を使用して、今日でも使用されているspoligotypingと名付けられたタイピング方法を設計しました。
スペインのアリカンテ大学のFrancisco Mojicaは、HaloferaxとHaloarcula種の古細菌で観察された反復とその機能を研究しました。Mojica の監督者は当時、同一の反復配列を持つプラスミドと染色体がHaloferax volcaniiで共存できないため、クラスター化された反復が細胞分裂中に複製された DNA を娘細胞に正しく分離する役割を持っていると推測しました。中断されたリピートの転写も初めて注目されました。これは、CRISPR の最初の完全な特徴付けでした。 2000 年までに、モジカは科学文献の調査を実施し、彼の学生の 1 人は、彼自身が考案したプログラムを使用して、公開されたゲノムを検索しました。彼らは、同じ科に属する微生物の 20 種の中断された反復を特定しました。これらの配列は間隔を空けて配置されていたため、Mojica は当初、これらの配列を「短い規則的な間隔の反復」(SRSR) と呼んでいました。 2001 年に、追加の中断された反復を探していたMojica とRuud Jansenは、頭字語 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) を提案し、科学文献で配列を説明するために使用される多数の頭字語に起因する混乱を軽減しました。 2002 年、タンら。Archaeoglobus fulgidusのゲノムからの CRISPR リピート領域が長い RNA 分子に転写され、その後、単位長の small RNA に処理され、2 つ、3 つ、またはそれ以上のスペーサー反復単位のいくつかのより長い形式が追加されたという証拠を示しました。
2005年、ヨーグルト研究者のRodolphe Barrangouは、 Streptococcus thermophilusがファージの攻撃を繰り返した後、ファージ耐性が増加することを発見しました。この耐性の強化は、追加のCRISPRスペーサー配列の組み込みによるものです。当時 Barrangou が働いていたデンマークの食品会社 Danisco は、ヨーグルト生産に使用するためのファージ耐性S. thermophilus株を開発しました。ダニスコは後に、「世界の酪農培養市場の約 50% を所有する」デュポンに買収され、この技術は主流になりました。
CRISPR 関連システム
CRISPR の理解への主要な追加は、原核生物の反復クラスターが CRISPR 関連システムまたはcas遺伝子を構成する相同遺伝子のセットを伴うという Jansen の観察によってもたらされました。4つのcas遺伝子（cas 1–4 ）が最初に認識されました。Cas タンパク質はヘリカーゼとヌクレアーゼの モチーフを示し、CRISPR 遺伝子座の動的構造における役割を示唆しています。この出版物では、頭字語 CRISPR がこのパターンの一般名として使用されました。しかし、CRISPR の機能は謎のままでした。
CRISPR遺伝子座の簡略図。CRISPR 遺伝子座の 3 つの主要なコンポーネントが表示されます: cas遺伝子、リーダー シーケンス、およびリピート スペーサー アレイ。繰り返しは灰色のボックスで表示され、スペーサーは色付きのバーで表示されます。3 つのコンポーネントの配置は、常に図のようになるとは限りません。
さらに、類似した配列を持つ複数の CRISPR が 1 つのゲノムに存在する可能性があり、そのうちの 1 つだけが
cas遺伝子と関連しています。
2005年、3つの独立した研究グループが、一部のCRISPRスペーサーがファージDNAやプラスミドなどの染色体外DNAに由来することを示しました。 実際には、スペーサーは以前に細胞を攻撃しようとしたウイルスから集められた DNA の断片です。スペーサーの供給源は、CRISPR/ casシステムが細菌の適応免疫に役割を果たしている可能性があるという兆候でした。 この考えを提案した 3 つの研究はすべて、最初は著名なジャーナルによって却下されましたが、最終的に他のジャーナルに掲載されました。
Mojica とアリカンテ大学の共同研究者による、微生物免疫における CRISPR-Cas の役割を提案した最初の出版物は、 RNA 干渉に類似しているメカニズムで、標的認識におけるスペーサーの RNA 転写物の役割を予測しました。真核細胞が使用するシステム。Kooninらは、タンパク質の予測される機能に従って、異なるCRISPR-Casサブタイプの作用メカニズムを提案することにより、このRNA干渉仮説を拡張しました。
いくつかのグループによる実験作業により、CRISPR-Cas 免疫の基本的なメカニズムが明らかになりました。2007 年、CRISPR が適応免疫システムであるという最初の実験的証拠が発表されました。 Streptococcus thermophilusの CRISPR 領域は、感染しているバクテリオファージの DNA からスペーサーを獲得しました。研究者らは、テストしたファージに見られる配列と一致する配列を持つスペーサーを追加および削除することにより、さまざまな種類のファージに対するS. thermophilusの耐性を操作しました。 2008 年、Brouns と Van der Oost は、大腸菌内でリピート内の CRISPR RNA 前駆体を CRISPR RNA (crRNA) と呼ばれる成熟したスペーサー含有 RNA 分子に切断するCas タンパク質の複合体 (Cascade と呼ばれる) を特定しました。 、タンパク質複合体に結合したままでした。さらに、Cascade、crRNA、およびヘリカーゼ/ヌクレアーゼ ( Cas3 ) が、 DNA ウイルスによる感染に対する免疫を細菌宿主に提供するために必要であることがわかった. アンチウイルス CRISPR を設計することにより、彼らは crRNA の 2 つの向き (センス/アンチセンス) が免疫を提供することを実証し、crRNA ガイドがdsDNAをターゲットにしていることを示しました。その年、Marraffini と Sontheimer は、S. epidermidisの CRISPR 配列が結合を防ぐために RNA ではなく DNA を標的にしたことを確認しました。この発見は、提案された CRISPR-Cas 免疫の RNA 干渉のようなメカニズムと矛盾していましたが、外来 RNA を標的とする CRISPR-Cas システムが後にPyrococcus furiosusで発見されました。 2010 年の研究では、CRISPR-Cas がS. thermophilusのファージとプラスミド DNA の両方の鎖を切断することが示されました。
Cas9 Cas9 研究者は、タンパク質Cas9に依存する化膿連鎖球菌由来のより単純な CRISPR システムを研究しました。Cas9エンドヌクレアーゼは、crRNA とトランス活性化 CRISPR RNA (tracrRNA) の 2 つの小分子を含む 4 成分系です。 Jennifer DoudnaとEmmanuelle Charpentierは、Cas9 エンドヌクレアーゼを再設計して、2 つの RNA 分子を「単一ガイド RNA」に融合させ、Cas9 と組み合わせたときに見つけて切断できるようにすることで、より管理しやすい 2 成分系にしました。ガイド RNA によって指定された DNA ターゲット。この貢献は非常に重要であり、2020 年のノーベル化学賞によって認められました。ガイド RNA のヌクレオチド配列を操作することにより、人工 Cas9 システムは、切断のために任意の DNA 配列を標的とするようにプログラムすることができました。 Virginijus Šikšnysと Gasiūnas、Barrangou、および Horvath を含む共同研究者の別のグループは、 S. thermophilus CRISPR システムの Cas9 も、その crRNA の配列を変更することにより、選択した部位を標的とするように再プログラムできることを示しました。これらの進歩により、修正された CRISPR-Cas9 システムを使用してゲノムを編集する取り組みが促進されました。
Feng ZhangとGeorge Churchが率いるグループは、初めて CRISPR-Cas9 を使用したヒト細胞培養におけるゲノム編集の説明を同時に発表しました。 それ以来、パン酵母 ( Saccharomyces cerevisiae ) 日和見病原体 カンジダ・アルビカンス を含む広範囲の生物で使用されている。ゼブラフィッシュ ( Danio rerio )、ショウジョウバエ(キイロショウジョウバエ)、 アリ ( Harpegnathos saltator およびOoceraea biroi )、蚊 (ネッタイシマカ )、線虫 ( Caenorhabditis elegans )、植物、マウス ( Mus musculus Domesticus )、 サルおよびヒト胚。
CRISPR は、科学者が特定の遺伝子を標的にして活性化またはサイレンシングできるようにするプログラム可能な転写因子を作成するように変更されています。
CRISPR-Cas9 システムは、中国の科学者 P. Liang と Y. Xu による 2015 年の論文で最初に記述されたヒト三核接合体で効果的な遺伝子編集を行うことを示しました。このシステムは、 54 個の胚のうち 28 個で変異ベータヘモグロビン(HBB) の切断に成功しました。28個の胚のうち4個は、科学者によって提供されたドナーテンプレートを使用して正常に再結合されました. 科学者たちは、切断された鎖の DNA 組換え中に、相同な内因性配列 HBD が外因性のドナー テンプレートと競合することを示しました。ヒト胚における DNA 修復は、派生幹細胞よりもはるかに複雑で特殊です。
Cas12a Cas12a 2015 年には、ヌクレアーゼ Cas12a (以前はCpf1 ) は、細菌Francisella novicidaのCRISPR/Cpf1システムで特徴付けられました。 2012 年に構築されたTIGRFAMタンパク質ファミリーの定義からの元の名前は、 PrevotellaおよびFrancisella系統における CRISPR-Cas サブタイプの普及を反映しています。Cas12a は、次のような Cas9 とのいくつかの重要な違いを示しました。Cas9 によって生成される「鈍い」切断とは対照的に、二本鎖 DNA に「ずれた」切断を引き起こすこと、「T リッチ」 PAMに依存すること (Cas9 に代替の標的部位を提供する)、ターゲティングを成功させるための CRISPR RNA (crRNA)。対照的に、Cas9 は crRNA とトランス活性化 crRNA (tracrRNA) の両方を必要とします。
これらの違いにより、Cas12a は Cas9 よりもいくつかの利点を得ることができます。たとえば、Cas12a の小さな crRNA は、Cas9 の sgRNA よりも多くを 1 つのベクターにパッケージ化できるため、多重ゲノム編集に最適です。同様に、Cas12a によって残された粘着性の 5′ オーバーハングは、従来の制限酵素クローニングよりもはるかにターゲット特異的な DNA アセンブリに使用できます。最後に、Cas12a は PAM サイトの下流の DNA 18 ～ 23 塩基対を切断します。これは、修復後に認識配列が破壊されないことを意味し、Cas12a は複数回の DNA 切断を可能にします。対照的に、Cas9 は PAM 部位の上流の 3 塩基対のみを切断するため、NHEJ 経路は認識配列を破壊するインデル変異をもたらし、それによってさらなる切断ラウンドを防ぎます。理論的には、DNA 切断を繰り返すことで、目的のゲノム編集が行われる機会が増えるはずです。 Cas9 と比較した場合の Cas12a の際立った特徴は、ターゲットを切断した後、Cas12a がターゲットに結合したままで、他の ssDNA 分子を無差別に切断することです。この特性は、「側副切断」または「トランス切断」活性と呼ばれ、さまざまな診断技術の開発に利用されてきました。
Cas13
2016 年、ヌクレアーゼ
Cas13a (以前は
細菌レプトトリキア・シャヒー由来のＣ２ｃ２ ）が特徴付けられた。Cas13 は RNA 誘導 RNA エンドヌクレアーゼであり、DNA を切断せず、一本鎖 RNA のみを切断します。Cas13 はその crRNA によって ssRNA ターゲットに誘導され、ターゲットに結合して切断します。Cas12a と同様に、Cas13 はターゲットに結合したままで、他の ssRNA 分子を無差別に切断します。この側副切断特性は、さまざまな診断技術の開発に利用されてきました。
遺伝子座の構造
リピートとスペーサー
CRISPR アレイは、AT リッチ リーダー シーケンスとそれに続く固有のスペーサーで区切られた短いリピートで構成されています。 CRISPR 反復は、通常、28 ～ 37塩基対(bps) のサイズの範囲ですが、最小で 23 bp、最大で 55 bp の場合も RNA にステムループ(「ヘアピン」)などの二次構造が形成されることを意味するダイアド対称性を示すものもあれば、構造化されないように設計されているものもある。異なる CRISPR アレイのスペーサーのサイズは、通常 32 ～ 38 bp (範囲 21 ～ 72 bp) です。新しいスペーサーは、ファージ感染に対する免疫応答の一部として急速に出現する可能性が通常、CRISPR アレイ内のリピートスペーサー配列は 50 ユニット未満です。
CRISPR RNA 構造
CRISPR-DR2
Rfamデータベース
から取得した二次構造
。ファミリ RF01315。
CRISPR-DR5
Rfamデータベース
から取得した二次構造
。ファミリ RF011318。
CRISPR-DR6
Rfamデータベース
から取得した二次構造
。ファミリ RF01319。
CRISPR-DR8
Rfamデータベース
から取得した二次構造
。ファミリ RF01321。
CRISPR-DR9
Rfamデータベース
から取得した二次構造
。ファミリ RF01322。
CRISPR-DR19
Rfamデータベース
から取得した二次構造
。ファミリ RF01332。
CRISPR-DR41
Rfamデータベース
から取得した二次構造
。ファミリ RF01350。
CRISPR-DR52
Rfamデータベース
から取得した二次構造
。ファミリ RF01365。
CRISPR-DR57
Rfamデータベース
から取得した二次構造
。ファミリ RF01370。
CRISPR-DR65
Rfamデータベース
から取得した二次構造
。ファミリ
RF01378。
Cas遺伝子とCRISPRサブタイプ
cas遺伝子の小さなクラスターは、多くの場合、CRISPR リピート スペーサー アレイの隣に位置しています。まとめて、コードされたタンパク質の配列類似性に基づいて、93 のcas遺伝子が 35 のファミリーにグループ化されます。35 ファミリーのうち 11 ファミリーがcasコアを形成し、これには Cas1 から Cas9 までのタンパク質ファミリーが含まれます。完全な CRISPR-Cas 遺伝子座には、 casコアに属する少なくとも 1 つの遺伝子が
CRISPR-Cas システムは 2 つのクラスに分類されます。クラス 1 システムは、複数の Cas タンパク質の複合体を使用して外来核酸を分解します。クラス 2 システムは、同じ目的で単一の大きな Cas タンパク質を使用します。クラス 1 は、タイプ I、III、および IV に分けられます。クラス 2 は、タイプ II、V、および VI に分けられます。 6 つのシステム タイプは 19 のサブタイプに分類されます。各タイプとほとんどのサブタイプは、そのカテゴリーにほぼ独占的に見られる「特徴遺伝子」によって特徴付けられる. 分類は、存在するcas遺伝子の補体にも基づいています。ほとんどの CRISPR-Cas システムには Cas1 タンパク質がCas1 タンパク質の系統発生は一般に分類システムと一致しますが、モジュール シャッフリングのために例外が存在します。多くの生物には複数の CRISPR-Cas システムが含まれており、それらが互換性があり、構成要素を共有している可能性があることを示唆しています。 CRISPR/Cas サブタイプの散発的な分布は、CRISPR/Cas システムが微生物の進化中に水平遺伝子伝達を受けやすいことを示唆している。
この表
には、UniProt と InterPro の相互参照 この情報を含めるには、表を展開して詳細はトークページにあるかもしれません。（ 2020年10月）
メジャーおよびマイナー CRISPR-cas タイプのシグネチャー遺伝子とその推定機能。
クラス
キャスタイプ
Casサブタイプ
シグネチャータンパク質
関数
参照1 I — Cas3
一本鎖 DNA ヌクレアーゼ (HD ドメイン) と ATP 依存性ヘリカーゼIA Cas8a、Cas5
Cas8 は干渉モジュールのサブユニットであり、PAM配列を認識して侵入 DNA を標的にするのに重要です。Cas5 は crRNA の処理と安定性に必要ですIB Cas8b IC Cas8c ID Cas10d 核酸ポリメラーゼおよびヌクレオチドシクラーゼのパームドメインと相同なドメインを含むIE Cse1、Cse2
もしも
Csy1、Csy2、Csy3
決まっていません
ＩＧGSU0054 Ⅲ — Cas10
Cas10dと Cse1 のホモログ。CRISPR ターゲット RNA に結合し、干渉複合体の安定性を促進しますIII-A Csm2
決まっていません
Ⅲ-B Cmr5 決まっていません III-C Cas10 または Csx11III-D Csx10 III-E III-F Ⅳ—Csf1 IV-A IV-B IV-C 2Ⅱ — Cas9
ヌクレアーゼRuvC と HNH は一緒にDSBを生成し、別々に一本鎖切断を生成できます。適応中の機能的スペーサーの獲得を保証します。II-A Csn2
リング状のDNA結合タンパク質。Type II CRISPR システムのプライミング適応に関与しています。
Ⅱ-B Cas4 cas1 および cas2 と連携してスペーサー配列を生成するエンドヌクレアーゼ II-C Csn2またはCas4が存在しないことを特徴とするⅤ — Cas12
ヌクレアーゼRuvC。HNHを欠いています。 VA Cas12a (Cpf1) VB Cas12b (C2c1) VC Cas12c (C2c3) VD Cas12d (CaY) VE Cas12e (CasX) VF Cas12f (Cas14、C2c10)VG Cas12g VH Cas12h ⅥCas12i VK
Cas12k (C2c5) VU C2c4、C2c8、C2c9Ⅵ — Cas13
RNA誘導RNase
経由
Cas13a (C2c2)VI-B Cas13b VI-C Cas13c
Ⅵ-D Cas13d
機構
適応免疫の 3 つの主要なタイプのそれぞれに対する CRISPR 免疫の段階。(1) 取得は、 Cas1と Cas2
による侵入 DNA の認識
とプロトスペーサーの切断によって開始されます。(2) プロトスペーサーは、リーダー配列に隣接する直接反復に連結され、 (3) 一本鎖伸長は CRISPR を修復し、直接反復を複製します。crRNA の処理と干渉の段階は、3 つの主要な CRISPR システムのそれぞれで異なって発生します。(4) 一次 CRISPR 転写物は cas 遺伝子によって切断され、crRNA を生成します。(5) タイプ I システムでは、Cas6e/Cas6f は、ssRNA と dsRNA の接合部で切断され、直接反復のヘアピン ループによって形成されます。タイプ II システムは、トランス活性化 (tracr) RNA を使用して dsRNA を形成し、これが
Cas9と RNaseIII によって切断されます。III 型システムは、切断のための直接反復にヘアピン ループを必要としない Cas6 ホモログを使用します。(6) タイプ II およびタイプ III のシステムでは、二次トリミングが 5′ または 3′ 末端で実行され、成熟した crRNA が生成されます。(7)成熟したcrRNAはCasタンパク質と結合して干渉複合体を形成します。(8) タイプ I およびタイプ II システムでは、タンパク質と PAM 配列の間の相互作用が侵入 DNA の分解に必要です。タイプ III システムは分解を成功させるために PAM を必要とせず、タイプ III-A システムでは、DNA ではなく crRNA と mRNA の間で塩基対形成が起こり、タイプ III-B システムの標的となります。
CRISPR 遺伝子座は、繰り返されるファージ感染から細菌を保護するための防御メカニズムを細菌に提供します。
CRISPR 遺伝子座の転写産物と pre-crRNA の成熟
CRISPR-Cas9 干渉複合体の 3D 構造
分子ツールとしての CRISPR-Cas9 は、標的の二本鎖 DNA 切断を導入します。
CRISPR-Cas9 によって導入された二本鎖 DNA 切断により、内因性 DNA 修復メカニズムを利用することで、さらなる遺伝子操作が可能になります。
CRISPR-Cas 免疫は、細菌と古細菌の自然なプロセスです。 CRISPR-Cas は、細胞に侵入する外来核酸を分解することにより、バクテリオファージの感染、抱合、および自然な形質転換を防ぎます。
スペーサー取得
微生物がバクテリオファージによって侵入されると、免疫応答の最初の段階は、ファージ DNA を捕捉し、それをスペーサーの形で CRISPR 遺伝子座に挿入することです。Cas1とCas2は両方のタイプの CRISPR-Cas 免疫系に見られ、スペーサー獲得に関与していることを示しています。変異研究はこの仮説を確認し、cas1またはcas2の除去がCRISPR 免疫応答に影響を与えずにスペーサー獲得を停止したことを示しています。
複数の Cas1 タンパク質が特徴付けられており、それらの構造が解明されています。 Cas1タンパク質は多様なアミノ酸配列を持っている。ただし、それらの結晶構造は類似しており、すべての精製された Cas1 タンパク質は、配列に依存しない方法で DNA に結合する金属依存性ヌクレアーゼ/インテグラーゼです。代表的な Cas2 タンパク質は特徴付けられており、(一本鎖) ssRNA- または (二本鎖) dsDNA- 特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を有する。
大腸菌の IE システムでは、Cas1 と Cas2 が複合体を形成し、Cas2 二量体が 2 つの Cas1 二量体を橋渡しします。この複合体では、Cas2 は非酵素的な足場の役割を果たし、侵入する DNA の二本鎖フラグメントを結合しますが、Cas1 は DNA の一本鎖側面に結合し、CRISPR アレイへの統合を触媒します。 通常、新しいスペーサーは、ウイルス感染の時系列記録を作成するリーダー配列の隣の CRISPR の先頭に追加されます。大腸菌では、リーダー配列に結合する統合宿主因子 ( IHF ) と呼ばれるヒストン様タンパク質が、この統合の正確さに関与しています。 IHF はまた、ペクトバクテリウム・アトロセプティカムの IF 型システムにおける統合効率を高めます。しかし、他のシステムでは、異なる宿主要因が必要になる場合がある
プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM)
詳細は「 プロトスペーサー隣接モチーフ」を参照
スペーサー（プロトスペーサーと呼ばれる）として切り出されたファージゲノムの領域のバイオインフォマティクス分析により、それらはランダムに選択されたのではなく、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短い（3〜5 bp）DNA配列に隣接して見つかったことが明らかになりました。CRISPR-Cas システムの分析により、取得中のタイプ I およびタイプ II では PAM が重要であることが示されましたが、タイプ III システムでは重要ではありませんでした。 タイプ I およびタイプ II のシステムでは、プロトスペーサーは PAM 配列に隣接する位置で切除され、スペーサーのもう一方の端は定規機構を使用して切断されます。したがって、CRISPRアレイのスペーサーサイズの規則性が維持されます。 PAM配列の保存はCRISPR-Casシステム間で異なり、進化的にCas1およびリーダー配列に関連しているように見える.
新しいスペーサーは、 優先的に発生するが、排他的ではなく、 リーダー配列に隣接して、方向性を持って CRISPR アレイに追加されます。大腸菌由来のＩＥ型システムの分析は、リーダー配列に隣接する最初の直接反復がコピーされ、新たに獲得されたスペーサーが最初と２番目の直接反復の間に挿入されることを実証した。
PAM シーケンスは、タイプ IE システムでスペーサーを挿入する際に重要であると思われます。その配列には、プロトスペーサーの最初の nt に隣接する、強く保存された最終ヌクレオチド (nt) が含まれています。この nt は、最初の直接反復の最終塩基になります。 これは、スペーサー獲得機構が、直接反復の最後から 2 番目の位置と、スペーサー挿入中に PAM に一本鎖オーバーハングを生成することを示唆しています。ただし、他の生物のPAMは最終位置で同じレベルの保存を示さないため、すべてのCRISPR-Casシステムがこのメカニズムを共有しているようには見えません. これらのシステムでは、獲得中にダイレクトリピートおよびプロトスペーサーの最後にブラントエンドが生成される可能性が高い。
挿入バリアント
Sulfolobus solfataricus CRISPRの分析により、6 つの CRISPR 遺伝子座の 1 つが新しいスペーサーをその CRISPR アレイ全体にランダムに挿入したため、スペーサー挿入の標準モデルがさらに複雑になることが明らかになりました。
複数の CRISPR には、同じファージに対する多くのスペーサーが含まれています。この現象を引き起こすメカニズムは、大腸菌のタイプIE系で発見されました。スペーサーがすでにファージをターゲットにしている場合、プロトスペーサーとのミスマッチであっても、スペーサー獲得の大幅な向上が検出されました。この「プライミング」には、取得と干渉の両方に関与する Cas タンパク質が互いに相互作用する必要がプライミングメカニズムに起因する新たに獲得されたスペーサーは、常にプライミングスペーサーと同じ鎖上に この観察は、新しいプロトスペーサーを見つけるためのプライミング後に獲得機構が外来 DNA に沿ってスライドするという仮説につながった。
生合成
CRISPR-RNA (crRNA) は、後で干渉ステップ中に Cas ヌクレアーゼをターゲットに導きますが、CRISPR シーケンスから生成する必要がcrRNA は、CRISPR 配列の多くを含む単一の長い転写産物の一部として最初に転写されます。この転写産物は Cas タンパク質によって切断され、crRNA を形成します。crRNA を生成するメカニズムは、CRISPR/Cas システムによって異なります。タイプ IE およびタイプ IF システムでは、タンパク質 Cas6e および Cas6f はそれぞれ、crRNAに隣接する同一の反復のペアリングによって作成されるステムループ を認識します。これらの Cas タンパク質は、対になった領域の端でより長い転写物を切断し、対になった反復領域の小さな残骸とともに単一の crRNA を残す。
タイプ III システムも Cas6 を使用しますが、それらの反復はステムループを生成しません。切断は代わりに、Cas6 の周りを包む長い転写産物によって発生し、反復配列のすぐ上流で切断が可能になります。
タイプ II システムは Cas6 遺伝子を欠いており、代わりに切断に RNaseIII を利用します。機能性 II 型システムは、トランス活性化 crRNA (tracrRNA)として知られる、反復配列に相補的な極小 RNA をエンコードします。 tracrRNA および一次 CRISPR 転写産物の転写により、反復配列での塩基対合および dsRNA の形成が起こり、その後 RNaseIII によって標的化されて crRNA が生成されます。他の 2 つのシステムとは異なり、crRNA には完全なスペーサーが含まれておらず、代わりに一方の端が切断されています。
CrRNA は Cas タンパク質と結合して、外来核酸を認識するリボヌクレオチド複合体を形成します。CrRNAは、コーディング鎖と非コーディング鎖の間で優先性を示さず、これはRNA誘導DNAターゲティングシステムを示しています。 IE型複合体（一般にカスケードと呼ばれる）は、単一のcrRNAに結合した5つのCasタンパク質を必要とする。
干渉
タイプ I システムの干渉段階では、PAM 配列が crRNA 相補鎖で認識され、crRNA アニーリングと共に必要とされます。タイプ I システムでは、crRNA とプロトスペーサーの間の正しい塩基対合が、DNA 分解のためにCas3をリクルートするカスケードのコンフォメーション変化を示します。
タイプ II システムは、干渉ステップで単一の多機能タンパク質Cas9に依存しています。 Cas9が機能するには crRNA と tracrRNA の両方が必要であり、そのデュアル HNH および RuvC/RNaseH 様エンドヌクレアーゼ ドメインを使用して DNA を切断します。タイプ II システムでは、PAM とファージ ゲノム間の塩基対形成が必要です。ただし、PAM は、crRNA と同じ鎖 (I 型システムとは逆の鎖) で認識されます。
タイプ III システムは、タイプ I と同様に、crRNA に結合する 6 つまたは 7 つの Cas タンパク質を必要とします。 S. solfataricusとP. furiosusから分析された III 型システムは両方とも、ファージ DNA ゲノムではなくファージの mRNA を標的とする 。ゲノム。タイプ III システムは、複合体中の異なる Cas タンパク質である Cas10 を使用して、RNA に加えて DNA を標的にすることもわかった。 DNA切断は転写依存性であることが示された。
干渉中に外来DNAから自己を区別するメカニズムはcrRNAに組み込まれているため、3つのシステムすべてに共通している可能性が各主要なタイプの独特の成熟プロセスを通じて、すべての crRNA には、スペーサー配列と、一端または両端の反復の一部が含まれます。CRISPR-Cas システムが染色体を標的とするのを防ぐのは、部分的な反復配列です。これは、スペーサー配列を超えた塩基対形成が自己にシグナルを送り、DNA の切断を防ぐためです。 RNA 誘導 CRISPR 酵素は、V 型制限酵素に分類されます。
進化
CRISPR 関連タンパク質 Cas2 (適応 RNase)
サーマス・サーモフィルス由来の仮想タンパク質tt1823の結晶構造
識別子
シンボル CRISPR_Cas2 プファム PF09827 インタープロPR019199 CDD d09638
利用可能なタンパク質構造:
プファム
構造物/ ECOD PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum 構造概要
CRISPR 関連タンパク質 CasA/Cse1 (タイプ I エフェクター DNase)
識別子
シンボル CRISPR_Cse1 プファム PF09481 インタープロPR013381 CDD d09729
利用可能なタンパク質構造:
プファム
構造物/ ECOD PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum 構造概要
CRISPR 関連タンパク質 CasC/Cse3/Cas6 (タイプ I エフェクター RNase)
サーマス・サーモフィラス由来のクリスパー関連タンパク質の結晶構造
識別子
シンボル CRISPR_assoc プファム PF08798 プファム一族 CL0362 インタープロPR010179 CDD d09727
利用可能なタンパク質構造:
プファム
構造物/ ECOD PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum 構造概要
CRISPR-Cas システムのアダプターおよびエフェクター モジュールの cas 遺伝子は、2 つの異なる祖先モジュールから進化したと考えられています。Cas1 様インテグラーゼをコードするカスポゾンと呼ばれるトランスポゾン様要素と、適応モジュールの潜在的に他のコンポーネントが、祖先エフェクター モジュールの隣に挿入されました。これは、おそらく独立した自然免疫系として機能していました。アダプターモジュールの高度に保存された cas1 および cas2 遺伝子は祖先モジュールから進化したが、さまざまなクラス 1 エフェクター cas 遺伝子は祖先エフェクターモジュールから進化した。これらのさまざまなクラス 1 エフェクター モジュール cas 遺伝子の進化は、重複イベントなどのさまざまなメカニズムによって導かれました。一方、クラス 2 エフェクター モジュールの各タイプは、可動性の遺伝要素のその後の独立した挿入から生じた。これらの移動可能な遺伝子要素は、複数の遺伝子エフェクター モジュールの代わりに、エフェクター モジュールのすべての必要なタスクを実行する大きなタンパク質を生成する単一の遺伝子エフェクター モジュールを作成します。 CRISPR-Cas システムのスペーサー領域は、外来の移動可能な遺伝要素から直接取得されるため、それらの長期的な進化を追跡することは困難です。これらのスペーサー領域の非ランダムな進化は、環境とそれに含まれる特定の外来の可動性遺伝要素に大きく依存することがわかっています。
CRISPR/Cas は、特定のファージに対して細菌を免疫化し、伝染を止めることができます。このため、Kooninは CRISPR/Cas をラマルク遺伝メカニズムと説明しました。しかし、これは批評家によって論争され、次のように述べた。進化が実際に機能するシンプルでエレガントな方法を覆い隠しています。」しかし、より最近の研究が行われるにつれて、CRISPR-Cas システムの後天的スペーサー領域は、後天的に受け継がれる遺伝子変異であるため、実際にはラマルク進化の一形態であることが明らかになりました。一方、システムを促進する Cas 遺伝子機構の進化は、古典的なダーウィンの進化を通じて進化する。
共進化
CRISPR 配列の分析により、宿主ゲノムとウイルスゲノムの共進化が明らかになりました。 Cas9 タンパク質は、病原性および共生細菌に非常に富んでいます。CRISPR/Cas を介した遺伝子調節は、特に真核生物宿主との相互作用中に、内因性細菌遺伝子の調節に寄与する可能性がたとえば、Francisella novicidaは、独自の小さな CRISPR/Cas 関連 RNA (scaRNA) を使用して、 F. novicidaにとって重要な細菌リポタンパク質をコードする内因性転写産物を抑制し、宿主応答を弱め、病原性を促進します。
CRISPR 進化の基本モデルは、新しく組み込まれたスペーサーがファージを駆動してゲノムを変異させ、細菌の免疫応答を回避し、ファージと宿主集団の両方に多様性を生み出すことです。ファージ感染に抵抗するには、CRISPR スペーサーの配列が標的ファージ遺伝子の配列と完全に一致している必要がファージは、スペーサーに点突然変異があると、宿主に感染し続けることができます。同様のストリンジェンシーが PAM で必要とされるか、細菌株はファージ感受性のままです。
料金
124 のS. thermophilus株の研究では、すべてのスペーサーの 26% が固有であり、異なる CRISPR 遺伝子座が異なるスペーサー獲得率を示したことが示されました。一部の CRISPR 遺伝子座は他の遺伝子座よりも急速に進化するため、株の系統関係を決定することができた。比較ゲノム解析では、大腸菌とS. entericaはS. thermophilusよりもはるかにゆっくりと進化することが示されました。25 万年前に分岐した後者の菌株には、同じスペーサー補体が含まれていました。
2 つの酸鉱山排水バイオ フィルムのメタゲノム解析は、分析された CRISPR の 1 つが他のバイオ フィルムに対して広範な欠失とスペーサーの追加を含むことを示しました。口腔では、経時的研究により、個人内で 17 か月にわたってスペーサーの 7 ～ 22% が共有され、個人間で共有されるのは 2% 未満であることが判明しました。
CRISPR システムに特異的なPCRプライマーを使用して、同じ環境から単一の菌株を追跡しました。スペーサーの存在/非存在の広範なレベルの結果は、有意な多様性を示しました。しかし、この CRISPR は 17 か月にわたって 3 つのスペーサーを追加し、重要な CRISPR 多様性を備えた環境であっても、一部の遺伝子座はゆっくりと進化することを示唆しています。
CRISPRは、ヒトマイクロバイオームプロジェクトのために作成されたメタゲノムから分析されました。ほとんどは身体部位に特異的であったが、身体部位内の一部は個人間で広く共有されている. これらの遺伝子座の 1 つは連鎖球菌種に由来し、約 15，000 個のスペーサーを含み、その 50% は固有のものでした。口腔の対象を絞った研究と同様に、時間の経過とともにほとんど進化を示さないものもありました。
CRISPR の進化は、スペーサー獲得率を直接調べるためにS. thermophilusを使用してケモスタットで研究されました。1 週間で、S. サーモフィラス株は、単一のファージで攻撃した場合、最大 3 つのスペーサーを獲得しました。同じ期間に、ファージは集団内で固定されるようになった一塩基多型を発達させ、ターゲティングがこれらの突然変異のないファージの複製を妨げたことを示唆している.
S. thermophilusの別の実験では、ファージが標的スペーサーを 1 つしか持たない宿主に感染して複製できることが示されました。さらに別の研究では、感受性の高い宿主がファージ力価の高い環境に存在できることが示されました。ケモスタットと観察研究は、CRISPR とファージ (共) 進化に多くのニュアンスを示唆している。
身元
CRISPR は細菌と古細菌の間で広く分布しており、いくつかの配列の類似性を示しています。それらの最も注目すべき特徴は、それらの反復スペーサーと直接反復である。この特徴により、DNA の長い配列で CRISPR を簡単に識別できます。これは、リピート数が偽陽性の一致の可能性を減少させるためです。
CRISPR 遺伝子座は通常、その繰り返しの性質やひずみの変化によって組み立てられず、アセンブリ アルゴリズムを混乱させるため、メタゲノム データ内の CRISPR の分析はより困難です。多くの参照ゲノムが利用可能な場合、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) を使用して CRISPR アレイを増幅し、スペーサーの内容を分析できます。 しかし、このアプローチは、特異的に標的とされたCRISPR、および信頼できるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーを設計するために公的データベースに十分な代表性を持つ生物に関する情報しか得られない。縮重反復特異的プライマーを使用して、環境サンプルから直接 CRISPR スペーサーを増幅できます。次に、2 つまたは 3 つのスペーサーを含むアンプリコンをコンピューターで組み立てて、長い CRISPR アレイを再構築できます。
別の方法は、ショットガン メタゲノム データから CRISPR アレイを抽出して再構築することです。これは、特に第 2 世代のシーケンシング技術 (454、Illumina など) では計算上より困難です。これは、読み取り長が短いため、1 回の読み取りで 2 つまたは 3 つを超える反復単位が現れるのを防ぐためです。生のリードでの CRISPR 同定は、純粋なde novo同定を使用するか、コンティグ(一緒になって DNA のコンセンサス領域を表す重複 DNA セグメント) から部分的に組み立てられた CRISPR アレイの直接反復配列を使用して達成されています 。公開されたゲノムは、個々の読み取りで直接反復を識別するためのフックとして使用されます。
ファージによる使用
細菌がファージ感染を防御するもう 1 つの方法は、染色体島を持つことです。ファージ誘導性染色体島 (PICI) と呼ばれる染色体島のサブタイプは、ファージ感染時に細菌の染色体から切除され、ファージの複製を阻害する可能性が PICI は、特定のブドウ球菌温帯ファージによって誘導、切除、複製され、最終的に小さなキャプシドにパッケージ化されます。PICI は、いくつかのメカニズムを使用してファージの複製をブロックします。最初のメカニズムでは、PICI でエンコードされた Ppi は、ファージ TerS と特異的に結合または相互作用することにより、ファージの成熟を特異的にブロックし、ファージ DNA パッケージングに関与するファージ TerS/TerL 複合体の形成をブロックします。第 2 のメカニズムでは、PICI CpmAB がファージ キャプシド形態形成タンパク質をリダイレクトして、SaPI サイズのキャプシドの 95% を作成し、ファージ DNA はこれらの小さなキャプシドにゲノムの 1/3 しかパッケージ化できないため、生存不能なファージになります。 3 番目のメカニズムには、ビリオンおよび溶解タンパク質の産生に関与する LtrC を標的とする 2 つのタンパク質、PtiA および PtiB が関与する。この干渉メカニズムは、調節タンパク質 PtiM によって調節され、干渉媒介タンパク質の 1 つである PtiA に結合するため、必要なレベルの干渉が達成されます。
ある研究では、Vibrio cholerae 血清群O1 を特異的に標的とする溶菌性 ICP1 ファージが、 V. cholera PICI 様要素を標的とする CRISPR/Cas システムを獲得したことが示されました。このシステムには、2 つの CRISPR 遺伝子座と 9 つの Cas 遺伝子がエルシニア ペスティスに見られる IF システムと相同性があるようです。さらに、細菌の CRISPR/Cas システムと同様に、ICP1 CRISPR/Cas は新しい配列を取得できるため、ファージと宿主が共進化することができます。
特定の古細菌ウイルスは、1 つまたは 2 つのスペーサーを含む mini-CRISPR アレイを運ぶことが示されました。ウイルスが媒介する CRISPR アレイ内のスペーサーは、他のウイルスやプラスミドを標的とすることが示されています。これは、ミニ CRISPR アレイが異型重感染排除のメカニズムを表し、ウイルス間の競合に関与していることを示唆しています。
アプリケーション
CRISPR遺伝子
CRISPR 遺伝子
CRISPR 技術は、プロバイオティクス培養を設計し、産業培養 (ヨーグルトなど) を感染に対して免疫化するために、食品および農業産業に適用されています。また、収量、干ばつ耐性、栄養価を高めるために作物にも使用されています。
2014 年末までに、CRISPR に言及した約 1000 の研究論文が発表されました。 この技術は、ヒトの細胞株や細胞の遺伝子を機能的に不活性化したり、カンジダ・アルビカンスを研究したり、バイオ燃料の製造に使用される酵母を改変したり、作物株を遺伝子改変したりするために使用されていた. Hsu と彼の同僚は、遺伝子配列を操作する能力により、バイオ燃料の生産にプラスの影響を与えるリバースエンジニアリングが可能になると述べている CRISPR は、蚊がマラリアなどの病気を伝染させないようにするためにも使用できる。 Cas12a を利用する CRISPR ベースのアプローチは、最近、多数の植物種の改変に成功しています。
2019 年 7 月、CRISPR は遺伝性疾患の患者を実験的に治療するために使用されました。患者は鎌状赤血球症の 34 歳の女性でした。
2020 年 2 月、 HIV治療が進展し、マウスに組み込まれたウイルス DNA の 60 ～ 80% が除去され、新しい抗レトロウイルス療法である LASER ART と CRISPR の両方を含む編集により、一部のマウスは完全にウイルスから解放されました。
2020 年 3 月、レーバー先天性黒内障の治療を目的として、CRISPR で改変されたウイルスが患者の眼に注射されました。
将来的には、CRISPR 遺伝子編集を使用して、新しい種を作成したり、近縁種から絶滅した種を復活させたりできる可能性が
遺伝子と疾患の関連性に関する主張の CRISPR ベースの再評価により、潜在的に重要な異常が発見されました。
診断ツールとしての CRISPR
COVID-19 ウイルスの分子検出方法の概略フローチャート
CRISPR関連ヌクレアーゼは、非標的配列の高いバックグラウンドで核酸配列を特異的に標的とする能力があるため、分子試験のツールとして有用であることが示されています。2016 年には、Cas9 ヌクレアーゼを使用して、次世代シーケンシング ライブラリの不要なヌクレオチド シーケンスを枯渇させましたが、必要な初期 RNA インプットはわずか 250 ピコグラムでした。 2017 年以降、CRISPR 関連ヌクレアーゼは、単一分子の感度に至るまで、核酸の直接診断テストにも使用されました。 CRISPR 多様性は、Martinsらによるキサントモナスなどの細菌の系統発生と多様性を識別するための分析対象として使用されます。、 2019年。_ _ _ ， 2020. : 553
CRISPR ベースの診断を追加の酵素プロセスに結合することにより、核酸を超えた分子の検出が可能になります。結合された技術の 1 つの例は、SHERLOCK ベースの in vitro 転写のプロファイリング (SPRINT) です。SPRINT を使用すると、患者サンプル中の代謝物や環境サンプル中の汚染物質などのさまざまな物質を、ハイスループットまたはポータブル ポイント オブ ケア デバイスで検出できます。 CRISPR/Cas プラットフォームは、 COVID-19を引き起こすウイルスであるSARS-CoV-2の検出 と不活性化のためにも調査されています。
こちらもご覧ください
アンチCRISPR
CRISPR/Cas ツール
CRISPR遺伝子
CRISPRジャーナル
ドラコ
遺伝子ノックアウト
遺伝学
ゲノム全体の CRISPR-Cas9 ノックアウト スクリーン
遺伝学用語集
ヒューマン・ネイチャー（2019 ドキュメンタリー映画)
プライムNAi iRNA
サーベイヤーヌクレアーゼアッセイ
合成生物学
ジンクフィンガー
ノート
^ サブタイプIGは、以前はサブタイプIUとして知られていました。
^ サブタイプVKは、以前はサブタイプVU 5として知られていました。
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外部リンク
化学”