HAT培地

HAT_medium

その他の使用法については、
Hatを参照して
HAT培地（ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン培地）は、哺乳類細胞培養用の選択培地であり、ジヒドロ葉酸レダクターゼを阻害することにより強力な葉酸代謝阻害剤として作用する薬剤であるアミノプテリンと、ヒポキサンチン（プリン誘導体）およびDNA合成の中間体であるチミジン（デオキシヌクレオシド） 。秘訣は、アミノプテリンが細胞分裂に絶対に必要なDNAdenovo合成をブロックすることです。続行しますが、ヒポキサンチンとチミジンは、適切な酵素を持っている場合、つまりそれらをコードする遺伝子の機能するコピーを持っている場合、閉塞を回避するための原料を細胞に提供します（「サルベージ経路」）。
致命的な
脾臓B細胞と融合した形質細胞腫
チミジンキナーゼ変異体によって示されるHAT選択 ジヒドロ葉酸の還元によってテトラヒドロ葉酸（THF）を生成する酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼは、アミノプテリンによって特異的にブロックされます。特定のタンパク質と関連して作用するTHFは、単一の炭素単位を受け取り、特定の標的に移動することができます。
細胞生殖の重要な標的の1つは、デオキシウリジン一リン酸（dUMP）からチミジル一リン酸（TMP）を生成するチミジル酸合成酵素です。追加のリン酸化反応により、TMPを使用してチミジン三リン酸（TTP）を作成できます。これは、 DNAポリメラーゼがDNAを作成するために使用する4つのヌクレオチド前駆体の1つです。dUMPの変換に必要なTHFがないと、TTPは存在せず、TMPを別のソースから生成できない限り、DNA合成を進めることはできません。代替の供給源は、細胞によって吸収され、チミジンキナーゼ（TK）によってTMPにリン酸化されることができるHAT培地に存在するチミジンです。
IMP（GMPとGTP、およびAMPとATPの前駆体）の合成にもTHFが必要であり、バイパスすることもできます。この場合、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）は、培地から吸収されたヒポキサンチンをPRPPと反応させ、ピロリン酸を遊離させ、サルベージ経路によってIMPを生成します。
したがって、細胞培養にHAT培地を使用することは、機能するTKおよびHGPRTを含む細胞の人工的な選択の一形態です。この計画に対する多くの有用な改良は、細胞を殺す毒によって可能になりますが、これらの遺伝子の1つを欠いている場合は免疫がしたがって、TKを欠く細胞はブロモデオキシウリジン（BrdU）に耐性があり、HGPRTを欠く細胞は6-チオグアニン（6-TG）と8-アザグアニンに耐性がしたがって、後者の2つの薬剤のいずれかを選択し、続いてHAT培地を選択すると、復帰型コロニーが生成されます。

アプリケーション
HAT培地はモノクローナル抗体の調製に使用されます。このプロセスはハイブリドーマテクノロジーと呼ばれます。実験動物（例えば、マウス）は、最初に、抗体の単離に関心のある抗原にさらされます。哺乳類から脾細胞が分離されると、B細胞はポリエチレングリコールまたはセンダイウイルスを使用してHGPRT陰性の不死化骨髄腫細胞と融合します。融合細胞はHAT培地で培養されます。培地中のアミノプテリンはdenovo経路を遮断します。したがって、融合していない骨髄腫細胞は、 denovoまたはサルベージ経路によってヌクレオチドを生成できないため、死にます。融合していないB細胞は寿命が短いため死にます。このようにして、B細胞と骨髄腫のハイブリッドのみが生き残ります。これらの細胞は抗体（B細胞の特性）を生成し、不死（骨髄腫細胞の特性）です。次に、培養された培地は、各ウェルが1つの細胞のみを含む程度までマルチウェルプレートに希釈されます。次に、各ウェルの上清をチェックして、目的の抗体を確認できます。ウェル内の抗体は同じB細胞によって産生されるため、同じエピトープに向けられ、モノクローナル抗体として知られています。
モノクローナル抗体の生産は、最初にセザールミルスタインとジョルジュJFケーラーによって発明され、ニールスカイジャーンと共有された1984年のノーベル生理学・医学賞を受賞しました。

参考文献
^ ホリデー、R; ホー、T（1998）。「内因性メチル化による遺伝子サイレンシングの証拠」。Proc Natl AcadSciUSA。95（15）：8727–32。Bibcode：1998PNAS…95.8727H。土井：10.1073/pnas.95.15.8727。PMC21144 。_ PMID9671746 。_