ネイルMS

NAIL-MS
NAIL-MS （核酸 同位体標識結合質量分析の略）は、核酸とその修飾の調査に使用される質量分析に基づく技術です。これにより、 in vivoでの RNA 生物学の根底にあるメカニズムを研究するためのさまざまな実験デザインが可能になります。例えば、生細胞における核酸の動的挙動、特にRNA 修飾の動的挙動をより詳細に追跡できます。
コンテンツ
1 仮説
2 一般的な手順
3 細胞の標識
4 アプリケーション
4.1 SILISの生産 4.2 比較実験 4.3 パルスチェイス実験 4.4 新しい RNA 修飾の発見 4.5 オリゴヌクレオチド NAIL-MS
5 参考文献
6 外部リンク

仮説
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シチジンの標識。左: 非標識シチジン、右: リボース標識シチジン (赤い点 = 13 C)。
NAIL-MS は、RNA 修飾メカニズムの研究に使用されます。したがって、培養中の細胞は、最初に安定同位体で標識された栄養素を与えられ、細胞はこれらを生体分子に組み込みます。核酸、ほとんどの場合RNAの精製後、分析は質量分析法によって行われます。質量分析は、イオンの質量電荷比を測定する分析技術です。異なる安定同位体組成の化学的に同一のヌクレオシドのペアは、質量の違いにより、質量分析計で区別できます。したがって、標識されていないヌクレオシドは、同位体標識された安定同位体と区別することができます。ほとんどの NAIL-MS アプローチでは、標識されたヌクレオシドが標識されていないヌクレオシドよりも 2 D​​a 以上重いことが重要です。これは、天然に存在する炭素原子の 1.1% が13 C 同位体であるためです。ヌクレオシドの場合、これはヌクレオシドの約 10% で 1 Da の質量増加につながります。この信号は、測定の最終評価を妨害します。
ネイル MS は、実験中に対応する成長培地のラベルの付いた栄養素を変更することによって RNA 変更のダイナミクスを調査する使用できます。さらに、細胞集団は、精製バイアスの影響を受けることなく、互いに直接比較することができます。さらに、質量分析による定量化に必要なほとんどのヌクレオシドの生合成同位体の生成や、未知の RNA 修飾の発見にも使用できます。

一般的な手順
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NAIL-MS アッセイの一般的なワークフロー。細胞は、収穫と RNA 分離の前に、適切に標識された培地で培養されます。さらなる RNA 精製に続いて、ヌクレオシドへの消化とその後のトリプル四重極質量分析が行われます。
一般に、細胞は無標識または安定（非放射性）同位体標識培地で培養されます。例えば、培地は、通常の炭素１２（１２ Ｃ）の代わりに、６個の炭素１３原子（１３ Ｃ）で標識されたグルコースを含むことができる。この培地で増殖する細胞は、モデル生物によっては、重いグルコースをすべての RNA 分子に取り込みます。その後、すべてのヌクレオチドは、リボースの完全な炭素標識により、標識されていないアイソトポログよりも 5 Da 重くなります。細胞の培養と適切な標識の後、それらは通常、フェノール/クロロホルム/グアニジンイソチオシアネートを使用して収穫されます。他の抽出方法も可能で、場合によっては必要になります (例: 酵母の場合)。RNA は、フェノール クロロホルム抽出とisoプロパノール沈殿によって分離されます。特定の RNA 種 (rRNA、tRNA など) のさらなる精製は通常、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC) によって行われますが、他のアプローチも利用できます。ほとんどのアプリケーションでは、 LC-MSによる分析の前に、最終生成物を酵素的にヌクレオシドに消化する必要がしたがって、ベンゾナーゼ、NP1、CIPなどの消化酵素が使用されます。 通常、MRM モードのトリプル四重極が測定に使用されます。

細胞の標識
RNA 分子の標識がどのように達成されるかは、モデル生物によって異なります。E.coli (細菌) の場合、最小培地 M9 を使用し、必要な塩の安定同位体標識バリアントを追加できます。これにより、 13 C-炭素、15 N-窒素、34 S-硫黄、および2 H-水素による標識が可能になります。 S. cerevisiae (酵母) には、現在 2 つの可能性があります: 1 つ目は、市販の完全増殖培地を使用することで、13 C-炭素および/または15 N-窒素による標識が可能になり、2 つ目は最小 YNB 培地を使用することです。 RNA の13 C-炭素、15 N-窒素、および2 H-水素標識を達成するために、安定同位体標識変異体として追加できるいくつかのアミノ酸とグルコースを補充する必要が
E.coliやS.cerevisiaeなどのモデル生物の標識はかなり単純ですが、細胞培養における安定同位体標識は、増殖培地の組成がはるかに複雑であるため、はるかに困難です。安定同位体標識グルコースの補充も、グルタミンおよび/またはアスパラギン酸などのヌクレオシド生合成の単純な前駆体の安定同位体標識変異体の補充も、 2 Da を超える定義された質量増加には十分ではありません。代わりに、細胞培養に保持されたほとんどの細胞は、メチル基の標識化のために安定同位体標識メチオニンを、ヌクレオシドの塩基体の標識化のためにアデニンとウリジンの安定同位体標識変異体を供給することができます。ヌクレオシドの生合成に使用される少量の代謝産物も含まれているため、培地に FBS (ウシ胎児血清) を補充する場合は特別な注意が必要です。したがって、すべてのヌクレオシドの定義された標識が必要な場合は、透析された FBS の使用をお勧めします。

アプリケーション
NAIL-MS では、さまざまな実験計画が可能です。

SILISの生産
NAIL-MS は、安定同位体標識内部標準 (ISTD) を生成するために使用できます。したがって、細胞はすべてのヌクレオシドの完全な標識をもたらす培地で増殖されます。精製されたヌクレオシド混合物は、質量分析によるヌクレオシドの正確な絶対定量に必要な ISTD として使用できます。この標識ヌクレオシドの混合物は、SILIS (安定同位体標識内部標準) とも呼ばれます。このアプローチの利点は、生物に存在するすべての修飾を標識化合物として生合成できることです。SILIS の製造は、NAIL-MS という用語が登場する前にすでに行われていました。

比較実験
比較 NAIL-MS 実験はSILAC実験と非常に似ていますが、タンパク質ではなく RNA を対象としています。まず、それぞれの細胞の 2 つの集団を培養します。細胞集団の 1 つには、標識されていない栄養素を含む増殖培地が与えられますが、2 番目の集団には、安定同位体標識された栄養素を含む増殖培地が与えられます。次に、細胞はそれぞれのアイソトポローグをそれらの RNA 分子に組み込みます。細胞集団の 1 つは対照群として機能し、もう 1 つは関連する研究 (KO 株、ストレスなど) の対象となります。2 つの細胞集団の収穫時に、それらは混合され、精製バイアスを排除するために一緒に処理されます。ヌクレオシドに取り込まれた栄養素の質量が異なるため、質量分析による 2 つの細胞集団の区別が可能です。

パルスチェイス実験
パルス追跡実験の開始時に、媒体は媒体(1)から媒体(2)に切り替えられます。2 つのメディアの同位体含有量のみが異なる必要がこれにより、実験開始前に既に存在していた RNA 分子 (= 培地で増殖した RNA 分子 (1)) と、実験開始後に新たに転写された RNA 分子 (= 培地で増殖した RNA 分子 (2)) を区別することができます。これにより、生体内での変更ダイナミクスの詳細な研究が可能になります。medium(1) または medium(2) に標識メチオニンを添加すると、メチル化プロセスを追跡できます。他の同位体標識代謝物は、さらなる修飾分析を可能にする可能性が
全体として、NAIL-MS により、質量分析による RNA 修飾ダイナミクスの調査が可能になります。この技術により、生きたバクテリア内のいくつかの RNA 損傷について、酵素による脱メチル化が観察されています。

新しい RNA 修飾の発見
特徴付けられていない修飾を発見するために、細胞を非標識または 13 C標識または 15 N標識または 2 H標識または 34 S標識培地で増殖させます。質量分析中に発生する未知の信号は、すべての差別的にラベル付けされた文化で検査されます。適切に発散するm/z値を持つ未知の化合物の保持時間が重複する場合、化合物の合計式は、差別的に標識された培養物で重複するシグナルの質量差を計算することによって仮定できます。この方法により、いくつかの新しい RNA 修飾が発見される可能性がこの実験計画は、NAIL-MS の概念を開始した最初のアイデアでもありました。

オリゴヌクレオチド NAIL-MS
NAIL-MS は、質量分析によるオリゴヌクレオチド分析にも適用できます。これは、シーケンス情報を保持する場合に役立ちます。

参考文献
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外部リンク
https://www.cup.lmu.de/oc/kellner/research/
https://iimcb.genesilico.pl/modomis/”