NASBA_(molecular_biology)
一般にNASBAと呼ばれる核酸配列ベースの増幅は、一本鎖 RNA の複数のコピーを生成するために使用される分子生物学の方法です。 NASBA は、RNA を取得し、特別に設計されたプライマーをアニールし、酵素カクテルを利用してそれを増幅する 2 段階のプロセスです。
コンテンツ
1 バックグラウンド2 歴史 3 手順
4 臨床応用
5 こちらもご覧ください
6 参考文献
バックグラウンド
核酸増幅は、RNA/DNA の特定のセグメントの複数のコピーを生成するために使用される技術です。増幅された RNA および DNA は、ジェノタイピング、配列決定、バクテリアやウイルスの検出など、さまざまなアプリケーションに使用できます。増幅には、非等温と等温の 2 種類が非等温増幅では、異なる温度間でサイクルを繰り返すことにより、RNA/DNA の複数のコピーが生成されます。等温増幅は、一定の反応温度で RNA/DNA の複数のコピーを生成します。 NASBA は一本鎖 RNA を取り込み、プライマーを 65℃ でアニールし、41℃ で増幅して一本鎖 RNA の複数のコピーを生成します。増幅を成功させるために、Avian Myeloblastosis Reverse Transcriptase (AMV-RT)、RNase H、および RNA ポリメラーゼを含む酵素カクテルが使用されます。プライマーがアニールされると、AMV-RT は RNA テンプレートから相補的 DNA 鎖 (cDNA) を合成します。次に RNase H が RNA テンプレートを分解し、もう一方のプライマーが cDNA に結合して二本鎖 DNA を形成し、RNA ポリメラーゼが RNA のコピーを合成するために使用します。 NASBA の重要な側面の 1 つは、出発物質と最終産物が常に一本鎖 RNA であることです。そうは言っても、DNA の増幅に使用できますが、増幅を成功させるには、DNA を RNA に翻訳する必要が
ループ媒介等温増幅(LAMP) は、別の等温増幅技術です。
歴史
NASBA は 1991 年に J Compton によって開発され、彼はそれを「1 つの温度で 1 つの混合物中の核酸の連続増幅に使用できるプライマー依存技術」と定義しました。 NASBA の発明直後、患者の血清中の HIV-1 の迅速な診断と定量化に使用されました。逆転写酵素を使用したPCRによって RNA を増幅することもできますが(相補的な DNA 鎖をテンプレートとして合成するため)、NASBA の主な利点は、通常 41 °C または使用するプライマーと酵素に応じて、2 つの異なる温度。2 つの異なる温度が適用された場合でも、これらの温度の間を行ったり来たりしないため、等温と見なされます。NASBA は、状況によってはより迅速で感度の高い PCR の代替として医療診断に使用できます。
手順
簡単に説明すると、NASBA は次のように機能します。
RNA テンプレートを反応混合物に加えると、5′ 末端に T7 プロモーター領域を持つ最初のプライマーが、テンプレートの 3′ 末端にあるその相補部位に結合します。
逆転写酵素は、逆の相補的 DNA鎖を合成し、プライマーの 3′ 末端を延長し、RNA テンプレートに沿って上流に移動します。
RNAse Hは DNA-RNA 化合物から RNA テンプレートを破壊します (RNAse H は RNA-DNA ハイブリッドの RNA のみを破壊しますが、一本鎖 RNA は破壊しません)。
2 番目のプライマーは、(アンチセンス) DNA 鎖の 5′ 末端に結合します。
逆転写酵素は、結合したプライマーから別の DNA 鎖を再び合成し、二本鎖 DNA を生成します。
T7 RNA ポリメラーゼは、二本鎖のプロモーター領域に結合します。T7 RNA ポリメラーゼは 3′ から 5′ 方向にしか転写できないため、センス DNA が転写され、アンチセンス RNA が生成されます。これが繰り返され、ポリメラーゼはこのテンプレートの相補的な RNA 鎖を継続的に生成し、増幅をもたらします。
ここで、前の手順と同様に循環フェーズを開始できます。ただし、ここでは、2 番目のプライマーが最初に (-)RNA に結合します。
逆転写酵素は、(+)cDNA/(-)RNA 二重鎖を生成します。
RNAse H は再び RNA を分解し、最初のプライマーが現在一本鎖の +(cDNA) に結合します。
逆転写酵素は相補的な (-) DNA を生成し、dsDNA デュプレックスを作成します。
ステップ 6 とまったく同様に、T7 ポリメラーゼがプロモーター領域に結合して (-)RNA を生成し、サイクルが完了します。
臨床応用
NASBA 技術は、インフルエンザ A ジカウイルス、口蹄疫ウイルス 重症急性呼吸器症候群( SARS )など、一本鎖 RNA ゲノムを持ついくつかの病原性ウイルスの迅速な診断テストの開発に使用されています。関連するコロナウイルス、 ヒト ボカウイルス(HBoV) 、およびトリパノソーマブルーセイなどの寄生虫。
最近、COVID-19 診断用に、蛍光、ディップスティック、および次世代シーケンシング読み出しによる NASBA 反応が開発されました。
こちらもご覧ください
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
参考文献
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