Riboprobe
リボプローブ ( RNA プローブの略称) は、in situ ハイブリダイゼーション中に標的 mRNA または DNA を検出するために使用できる標識された RNA のセグメントです。 RNAプローブは、ウイルス プロモーターの下流の適切なプラスミドに挿入されたクローン化DNAのin vitro転写によって生成できます。一部の細菌ウイルスは、ウイルス プロモーターに対して高度に特異的な独自のRNA ポリメラーゼをコードします。これらの酵素を使用して、標識されたNTP、および順方向と逆方向の両方で挿入されたインサートを使用すると、クローン化された遺伝子からセンスおよびアンチセンスの両方のリボプローブを生成できます。
James WatsonとFrancis Crick がDNA 分子の二重らせんの性質を明らかにして以来(Watson & Crick， 1953 )、4 つの塩基間の水素結合はよく知られています。アデニンは常にチミンに結合し、シトシンは常にグアニンに結合します。この結合パターンは、現代の遺伝子技術の基本原理です。Joseph Gall と Mary Lou Pardue は、放射性標識されたリボソーム DNA をカエルの卵の相補 DNA 配列の検出に使用できることを実証する論文を 1969 年に発表しました 。彼は、DNA プローブを使用して in situ ハイブリダイゼーションを実行した最初の研究者として知られています。RNA プローブは同じ機能を実行できることが証明されており、in situ ハイブリダイゼーションでも使用されます。安全性、安定性、検出の容易さを考慮して、放射性標識プローブに代わって蛍光染色プローブが使用されました。 DNA 配列の検出は、「干し草の山から針を探すことと似ています。針は目的の DNA 配列であり、干し草の山は染色体のセットです」。DNA ヘリックスの解離、再アニール能力、および塩基対合の驚くべき精度により、リボプローブは染色体上の相補的な DNA 配列の位置を特定することができます。
アプリケーション
in situ ハイブリダイゼーション中に使用されるプローブには、リボプローブと DNA オリゴヌクレオチド プローブの 2 種類がリボプローブは、DNA プローブが不十分な胚発生の研究には不可欠です。標識（蛍光染色など）されたアンチセンス RNA プローブが発生中の胚の mRNA とハイブリダイズすると、発生のさまざまな段階での遺伝子の発現を追跡することが可能になります。RNA プローブは、胚全体の発生を検出するか、対象の組織切片のみを検出するのに使用できます。リボプローブは転写された mRNA に結合する能力があるため、RNA プローブは、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、アフリカツメガエル、マウスなどのモデル生物の研究において重要になります。 RNA プローブは、胚の組織感染を特定するために免疫組織化学でも利用できます。ウイルス mRNA は、そのアンチセンス RNA プローブによって標的にされることができますが、感染組織にはプローブとハイブリダイズできる相補的 mRNA がありません。各生物の固有の mRNA 配列により、特定の遺伝子の発現の検出が非常に効果的かつ正確になります。
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH) は、最も広く使用されているリボプローブ技術です。FISHではターゲット配列とプローブが必須です。まず、プローブは直接または間接標識戦略のいずれかで標識されます。間接標識ではハプテン修飾ヌクレオチドが使用され、直接標識ではフルオロフォア修飾ヌクレオチドが使用されます。ターゲット DNA とプローブは変性されて混合され、DNA 配列の再アニーリングが可能になります。間接標識では、酵素または免疫系の使用を必要とする可視化シグナルを生成するための追加のステップが必要ですが、直接標識よりも大きなシグナル増幅が得られます。
FISH プローブは核型研究にも使用できます。DNA プローブは、各染色体に固有の色を生成するさまざまな蛍光色素で標識できます。次に、プローブは中期染色体とハイブリダイズし、各染色体上に固有のパターンを生成します。この方法は、部位特異的 FISH と比較して、染色体の転座、欠失、重複を大規模に研究したい場合に役立ちます。
参考文献
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外部リンク
YouTube ビデオ:in situ ハイブリダイゼーション
https://www.youtube.com/watch?v=1iRynlXIJw0
蛍光 In situ ハイブリダイゼーションの詳細な説明:
http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescent-in-situ-hybridization-fish-327#
Riboprobe In Vitro 転写システム技術マニュアル:
https://www.promega.com/resources/protocols/technical-manuals/0/riboprobe-in-vitro-transcription-systems-protocol/