Ribosome_display
リボソーム ディスプレイは、 in vitro で タンパク質進化を実行し、目的のリガンドに結合できるタンパク質を作成するために使用される技術です。このプロセスにより、選択ステップで固定化リガンドに結合するために複合体として使用されるmRNA前駆体と結合する翻訳されたタンパク質が生成されます。次に、よく結合する mRNA とタンパク質のハイブリッドがcDNAに逆転写され、その配列がPCRによって増幅されます。その結果、強固に結合するタンパク質の作成に使用できるヌクレオチド配列が得られます。
コンテンツ
1 リボソーム表示プロセス
2 リボソームディスプレイの利点
3 こちらも参照
4 参考文献
リボソーム表示プロセス
リボソームディスプレイは、ポリペプチドをコードする DNA 配列のネイティブ ライブラリーから始まります。各配列は転写され、次にin vitroでポリペプチドに翻訳されます。しかし、結合タンパク質の特定のライブラリーをコードする DNA ライブラリーは、その終了前に終止コドンを欠くスペーサー配列に遺伝的に融合されます。終止コドンが欠如しているため、放出因子が結合して翻訳複合体の分解を引き起こすことが妨げられます。したがって、このスペーサー配列はペプチジル tRNA に結合したままでリボソーム トンネルを占有し、目的のタンパク質がリボソームから突き出て折りたたまれることを可能にします。結果として得られるのは、表面結合リガンドに結合できる mRNA、リボソーム、タンパク質の複合体です。この錯体は、温度を下げたり、Mg 2+などのカチオンを添加したりすると安定化します。
その後の結合、つまりパンニングの段階で、複合体は表面に結合したリガンドに導入されます。これは、リガンドを含む樹脂ベッドを備えたアフィニティークロマトグラフィーカラム、表面結合リガンドが固定化された96ウェルプレート、またはリガンドでコーティングされた磁気ビーズを使用するなど、いくつかの方法で実現できます。よく結合する複合体は固定化されます。その後、高濃度の塩、キレート剤、またはタンパク質の結合モチーフと複合体を形成する可動性リガンドを介してバインダーを溶出すると、mRNA が解離します。次に、mRNA を逆転写して cDNA に戻し、突然変異誘発を受け、より優れた結合剤を単離するためにより高い選択圧をかけてプロセスに繰り返し供給することができます。
リボソームディスプレイの利点
タンパク質前駆体を複合体に結合させることにより、リボソームディスプレイのプロセスでは、ヌクレオチドハイブリダイゼーションを含むアッセイでは一般的なマイクロアレイ/ペプチドビーズ/マルチウェル配列の分離が省略され、結合するタンパク質を解読することなく増幅するための簡単な方法が提供されます。必要になるまで順番に実行します。同時に、この方法は、ギャップのない配列多様性の大規模で濃縮されたプールを生成し、配列空間ギャップを生み出すような方法でこれらの配列が分解、ハイブリダイズ、および相互に反応するのを防ぐことに依存しています。
抗体およびタンパク質治療リードのエンジニアリングにおいて成功した実績があり、これらの分野では現在でも広く使用されています。
in vitro でのタンパク質進化の競合する方法は、ファージ ディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、およびmRNA ディスプレイです。ペプチド (Mattheakis、Bhatt および Dow) 完全に in vitro で実行されるため、他の選択技術に比べて 2 つの主な利点が第一に、ライブラリーの多様性は細菌細胞の形質転換効率によって制限されるのではなく、試験管内に存在するリボソームおよびさまざまな mRNA 分子の数によってのみ制限されます。第二に、多様化ステップの後にライブラリーを形質転換する必要がないため、各選択ラウンドの後にランダムな突然変異を簡単に導入できます。これにより、数世代にわたる結合タンパク質の指向性進化が容易になります。
ライブラリーからタンパク質を選択するための前提条件は、遺伝子型 (RNA、DNA) と表現型 (タンパク質) の組み合わせです。リボソームディスプレイでは、この結合は、リボソーム、mRNA、および正しく折り畳まれた新生ポリペプチドからなる複合体を安定化することによって、インビトロ翻訳中に達成されます。リボソーム複合体は、表面に固定化された標的に結合することができます。結合していない複合体は洗い流されるが、結合ポリペプチドを提示する複合体のmRNAは回収できるため、結合ポリペプチドの遺伝情報を分析に利用できる。
こちらも参照
mRNAディスプレイ
参考文献
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