Type_three_secretion_system
タイプ3分泌システム(多くの場合、タイプIII分泌システムと呼ばれ、TTSSまたはT3SSと略され、インジェクティソームとも呼ばれます)は、いくつかのグラム陰性菌に見られるタンパク質付属物です。
Salmonellatyphimuriumから単離されたT3SS針状複合体の透過型電子顕微鏡画像
病原性細菌では、針状の構造が存在を検出する感覚プローブとして使用され、真核 生物および分泌する細菌が助けタンパク質感染して。分泌されたエフェクタータンパク質は、細菌細胞から真核生物(宿主)細胞に直接分泌され、そこで病原体が生き残り、免疫応答を逃れるのを助ける多くの効果を発揮します。
コンテンツ
1 概要
2 構造
3 T3SSタンパク質
4 分泌の誘導
5 T3SSを介した感染
6 未解決の問題
7 T3SSタンパク質の命名法
8 T3SS研究で採用された方法
8.1 T3SS針複合体の分離 8.2 顕微鏡学、結晶学および固体NMR 8.3 プロテオミクス 8.4 遺伝的および機能的研究 8.5 T3SSの阻害剤
9 タイプIIIシグナルペプチド予測ツール
10 参考文献
11 参考文献
概要
タイプIII分泌システムという用語は1993年に造られました。この分泌システムは、グラム陰性菌に見られる少なくとも5つの他の分泌システムとは区別されます。多くの動植物関連細菌は同様のT3SSを持っています。これらのT3SSは、分岐進化の結果として類似しており、系統発生分析は、グラム陰性菌がT3SS遺伝子カセット を他の種に水平に移すことができるモデルをサポートします。最も研究さT3SSsの種からのもの赤痢菌(原因となる細菌性赤痢を、)サルモネラ(腸チフス)、大腸菌(腸内細菌叢、原因一部の株食中毒)、ビブリオ(胃腸炎や下痢)、バークホルデリア(鼻疽)、エルシニア(ペスト) 、Chlamydia(性感染症)、Pseudomonas(人間、動物、植物に感染)、植物病原菌 Erwinia、Ralstonia、Xanthomonas、植物共生菌Rhizobium。
T3SSは約30種類のタンパク質で構成されており、最も複雑な分泌システムの1つとなっています。その構造は、細菌のべん毛と多くの類似点を示しています(運動性に使用される長くて硬い細胞外構造)。T3SSに関与するタンパク質のいくつかは、べん毛タンパク質とアミノ酸配列の相同性を共有しています。T3SSを保有する細菌の中には、べん毛もあり、運動性があるもの(たとえば、サルモネラ菌)とそうでないもの(たとえば、赤痢菌)が技術的に言えば、III型分泌は感染関連タンパク質とべん毛成分の両方を分泌するために使用されます。ただし、「III型分泌」という用語は、主に感染装置に関連して使用されます。細菌のべん毛は、III型分泌システムと共通の祖先を共有しています。
T3SSは、多くの病原菌の病原性(感染能力)に不可欠です。T3SSの欠陥は、細菌を非病原性にする可能性がエネルギー的に高価なシステムがもはや使用されていないため、グラム陰性菌のいくつかの非侵襲性菌株がT3SSを失ったことが示唆されています。過去には、従来の抗生物質がこれらの細菌に対して有効でしたが、抗生物質耐性菌が絶えず出現しています。T3SSの仕組みを理解し、それをターゲットにした医薬品を開発することは、1990年代後半以降、世界中の多くの研究グループの重要な目標になっています。
構造
タイプIII分泌システム
T3SSニードルコンプレックス
識別子
シンボル3SS TCDB .B.22 OPMスーパーファミリー 348 OPMタンパク質 5tcq T3SSの特徴は、針である (より一般的には、複合針(NC)またはT3SS装置(T3SAが)とも呼ばinjectisome ATPアーゼが除外され、以下を参照のこと)。分泌される必要のある細菌タンパク質は、細菌の細胞質から針を通って直接宿主の細胞質に通過します。3つの膜が2つの細胞質を分離します:グラム陰性菌の二重膜(内膜と外膜)と真核生物の膜です。針は、これらの高度に選択的でほとんど不浸透性の膜をスムーズに通過します。単一の細菌は、その膜全体に広がる数百の針状複合体を持つことができます。針状複合体は、病原菌のすべてのT3SSの普遍的な特徴であるます。
針状複合体は細菌の細胞質から始まり、2つの膜を横切り、細胞から突き出ています。膜に固定されている部分は、T3SSのベース(または基底小体)です。細胞外部分は針です。いわゆるインナーロッドが針をベースに接続します。針自体は、T3SSの最大かつ最も顕著な部分ですが、単一のタンパク質の多くのユニットから作られています。したがって、さまざまなT3SSタンパク質の大部分は、ベースを構築するものと、宿主に分泌されるものです。上記のように、針状複合体は細菌べん毛と類似点を共有しています。より具体的には、針状複合体の基部は、べん毛基部と構造的に非常に似ています。針自体は、ベースをべん毛フィラメントに接続する構造であるべん毛フックに類似しています。
ベースはいくつかの円形リングで構成されており、新しいニードルコンプレックスに組み込まれた最初の構造です。ベースが完成すると、それは外側のタンパク質(針)の分泌機として機能します。複合体全体が完了すると、システムは、宿主細胞に送達されることを目的とした分泌タンパク質に切り替わります。針は下から上に作られていると推定されます。針モノマータンパク質の単位が互いに重なり合うため、針の先端の単位が最後に追加されます。針サブユニットは、約9 k Daの最小のT3SSタンパク質の1つです。100〜150個のサブユニットが各針を構成します。
60〜80周りのT3SS針対策nmの長さおよび外部幅は8nmで。他の細胞外細菌構造(アドヘシンやリポ多糖層など)が分泌を妨げないように、最小の長さである必要が針の穴の直径は3nmです。ほとんどの折りたたまれたエフェクタータンパク質は非常にほとんど分泌されたタンパク質は、針を通過しなければならない、針開口部を通過するには大きすぎる展開された、タスクがで行わATPアーゼ構造の基部に。
T3SSタンパク質
Salmonellatyphimuriumからの針状複合体の個々の下部構造の図
T3SSタンパク質は、次の3つのカテゴリに分類できます。
構造タンパク質:ベース、インナーロッド、ニードルを構築します。
エフェクタータンパク質:宿主細胞に分泌され、感染を促進/宿主細胞の防御を抑制します。
シャペロン:細菌の細胞質内のエフェクターに結合し、凝集や分解からエフェクターを保護し、針状複合体に向けます。
ほとんどのT3SS遺伝子はオペロンに配置されています。これらのオペロンは、一部の種では細菌の染色体上にあり、他の種では専用のプラスミド上にたとえば、サルモネラ菌には、ほとんどのT3SS遺伝子が集まっている染色体領域、いわゆるサルモネラ 病原性島(SPI)が一方、赤痢菌は、すべてのT3SS遺伝子が存在する大きな病原性プラスミドを持っています。多くの病原性アイランドおよびプラスミドには、アイランド/プラスミドの新しい種への頻繁な水平遺伝子伝達を可能にする要素が含まれていることに注意することが重要です。
針から分泌されるエフェクタータンパク質は、他の何千ものタンパク質と一緒に細胞質に浮遊するため、システムによって認識される必要が認識を介して行われる分泌シグナル先頭(位置のアミノ酸の短い配列-a N末端ニードル複合体が認識することができること、(通常は最初の20個のアミノ酸内)タンパク質の)。他の分泌システムとは異なり、T3SSタンパク質の分泌シグナルがタンパク質から切断されることはありません。
分泌の誘導
針が宿主細胞に接触すると、T3SSが分泌を開始します。このトリガーメカニズムについてはあまり知られていません(以下を参照)。分泌は、増殖培地中のカルシウム イオンの濃度を下げることによって(エルシニアおよびシュードモナスの場合; EDTAまたはEGTAなどのキレート剤を加えることによって行われる)、および芳香色素コンゴーレッドを増殖培地に加えることによって(赤痢菌の場合)、誘発することもできます。例えば。これらの方法やその他の方法は、III型分泌を人工的に誘発するために実験室で使用されています。
宿主細胞との接触以外の外部の手がかりによる分泌の誘導もまた、感染した生物において、インビボで起こる。バクテリアは、温度、pH、浸透圧、酸素レベルなどの手がかりを感知し、それらを使用してT3SSを活性化するかどうかを「決定」します。たとえば、サルモネラ菌は、動物の腸の盲腸よりも回腸で複製し、よりよく侵入することができます。バクテリアは、これらの領域に存在するさまざまなイオンのおかげで、それらがどこにあるかを知ることができます。回腸にはギ酸塩と酢酸塩が含まれていますが、盲腸には含まれバクテリアはこれらの分子を感知し、回腸にあると判断し、分泌機構を活性化します。プロピオン酸や酪酸などの盲腸に存在する分子は、細菌に否定的な手がかりを提供し、分泌を阻害します。ほとんどの真核細胞膜に見られる脂質であるコレステロールは、赤痢菌で分泌を誘発することができます。
上記の外部の手がかりは、直接または遺伝的メカニズムを介して分泌を調節します。T3SS遺伝子の発現を調節するいくつかの転写因子が知られています。T3SSエフェクターに結合するシャペロンのいくつかは、転写因子としても機能します。フィードバックメカニズムが示唆されています:細菌が分泌しない場合、そのエフェクタータンパク質はシャペロンに結合し、細胞質に浮かんでいます。分泌が始まると、シャペロンはエフェクターから分離し、エフェクターは分泌されて細胞を離れます。次に、孤独なシャペロンは転写因子として作用し、それらのエフェクターをコードする遺伝子に結合し、それらの転写を誘導し、それによってより多くのエフェクターの産生を誘導します。
Type3SSインジェクティソームと同様の構造が、グラム陰性菌の外膜および内膜をリベットで留めて、細菌分泌物を真核生物の宿主または他の標的細胞にインビボで送達することを目的とした外膜小胞の放出を助けるる。
T3SSを介した感染
T3SSエフェクターは、基部で針複合体に入り、針の内側で宿主細胞に向かって進みます。エフェクターがホストに入る正確な方法はほとんど不明です。針自体が宿主細胞膜に穴を開けることができることが以前に示唆されていた。この理論は反駁されています。まとめてトランスロケーターと呼ばれるいくつかのエフェクターが最初に分泌され、宿主細胞膜に細孔またはチャネル(トランスロコン)を生成し、そこから他のエフェクターが入る可能性があることは今や明らかです。トランスロケーターを欠く変異細菌はタンパク質を分泌することはできますが、それらを宿主細胞に送達することはできません。一般に、各T3SSには3つのトランスロケーターが含まれています。一部のトランスロケーターは2つの役割を果たします。それらが細孔形成に関与した後、それらは細胞に入り、真正なエフェクターとして機能します。
T3SSエフェクターはいくつかの方法で宿主細胞を操作します。最も顕著な効果は、宿主細胞による細菌の取り込みの促進です。T3SSを保有する多くの細菌は、感染を複製して増殖させるために宿主細胞に侵入しなければなりません。それらが宿主細胞に注入するエフェクターは、宿主に細菌を飲み込み、実際にそれを「食べる」ように誘導します。これが起こるために、細菌エフェクターは宿主細胞のアクチン 重合機構を操作します。アクチンは細胞骨格の構成要素であり、運動性や細胞形状の変化にも関与しています。そのT3SSエフェクターを通して、細菌はそれ自身の利益のために宿主細胞自身の機械を利用することができます。細菌が細胞に入ると、他のエフェクターをより簡単に分泌することができ、隣接する細胞に浸透して組織全体にすばやく感染することができます。
T3SSエフェクターは、宿主の細胞周期を改ざんすることも示されており、それらのいくつかはアポトーシスを誘導することができます。ほとんどの研究T3SSエフェクターの一つは、IPABからフレクスナー赤痢菌。それは、宿主細胞膜に細孔を形成するトランスロケーターとして、および宿主細胞に複数の有害な効果を及ぼすエフェクターとしての両方の二重の役割を果たします。IpaBは、マクロファージに飲み込まれた後、マクロファージ(動物の免疫系の細胞)にアポトーシスを誘導することが実証されています。後に、IpaBが真核細胞の主要な調節タンパク質であるカスパーゼ1と相互作用することによってこれを達成することが示されました。
T3SSエフェクターのもう1つのよく特徴付けられたクラスは、XanthomonasのTranscription Activator-likeエフェクター(TALエフェクター)です。植物に注入されると、これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、植物プロモーター配列に結合し、細菌感染を助ける植物遺伝子の転写を活性化することができます。 TALエフェクター-DNA認識は、単純なコードを含むことが最近実証されており 、これにより、これらのタンパク質が宿主植物細胞の遺伝子の転写をどのように変化させるかについての理解が大幅に向上しました。
未解決の問題
サルモネラ針複合体のトポロジーと構成
90年代半ば以降、T3SSに関する何百もの記事が公開されています。ただし、システムに関する多くの問題は未解決のままです。
T3SSタンパク質。各生物の10未満の約30のT3SSタンパク質のうち、生化学的方法を使用して直接検出されています。残りはおそらくまれですが、検出が困難であることが証明されており、理論的なままです(ただし、生化学的研究ではなく遺伝学的研究が多くのT3SS遺伝子/タンパク質で行われています)。各タンパク質の局在も完全にはわかっ
針の長さ。新しい針が適切な長さに達したときに細菌がどのように「知る」かは不明です。いくつかの理論が存在しますが、その中には、針の先端と基部を何らかの形で接続する「定規タンパク質」の存在が針の先端に新しいモノマーを追加すると、定規タンパク質が伸び、それによって針の長さを基部に知らせる必要が
エネルギー学。針の中のタンパク質の通過を駆動する力は完全にはわかっAN ATPアーゼは、 T3SS針にタンパク質を導くことに関与する塩基に関連しています。しかし、それが輸送のためのエネルギーを供給するかどうかは明らかではありません。
分泌シグナル。上記のように、エフェクタータンパク質における分泌シグナルの存在は知られている。この信号により、システムはT3SSで輸送されるタンパク質を他のタンパク質と区別することができます。その性質、要件、認識のメカニズムはよくわかっていませんが、III型分泌システムによってどの細菌タンパク質を輸送できるかを予測する方法が最近開発されました。
分泌物の活性化。細菌は、エフェクターを分泌するのに適切な時期を知る必要が宿主細胞が近くにない場合の不必要な分泌は、エネルギーと資源の点で細菌にとって無駄です。細菌はどういうわけか針と宿主細胞との接触を認識することができます。これがどのように行われるかはまだ研究中であり、その方法は病原体に依存している可能性がいくつかの理論は、宿主細胞との接触時に針の構造の微妙な構造変化を仮定しています。この変化は、おそらくベースが分泌を開始するためのシグナルとして機能します。サルモネラ菌で認識の1つの方法が発見されました。これは、エフェクターの分泌をオンにするために、病原性島2でエンコードされたT3SSを介して宿主細胞の細胞質ゾルのpHを感知することに依存しています。
シャペロンの結合。シャペロンがいつエフェクターに結合するか(翻訳中か翻訳後か)、および分泌前にエフェクターからどのように解離するかは不明です。
エフェクターメカニズム。21世紀の初め以来、T3SSエフェクターが宿主を操作する方法について多くのことが明らかにされましたが、効果と経路の大部分は不明なままです。
進化。前述のように、T3SSは細菌のべん毛と密接に関連しています。 3つの競合する仮説があります:最初に、べん毛が最初に進化し、T3SSがその構造から派生した、2番目に、T3SSが最初に進化し、べん毛がそれから派生した、そして3番目に、2つの構造が共通の祖先から派生しています。さまざまなシナリオについていくつかの論争がありました 。これらはすべて、2つの構造間のタンパク質の相同性と、機能の多様性を説明しているためです。それでも、最近の系統発生学的証拠は、T3SSが最初の遺伝子喪失とその後の遺伝子獲得を含むプロセスによってべん毛に由来するという仮説を支持している。後者のプロセスの重要なステップは、T3SSへのセクレチンの補充でした。これは、他の膜関連システムから少なくとも3回発生したイベントです。
T3SSタンパク質の命名法
グラム陰性菌のべん毛。ベースのリングは針複合リングと非常に似ていますが、針複合体にCリングが存在することは証明されべん毛フックはT3SS針と相同です
1990年代の初め以来、新しいT3SSタンパク質がさまざまな細菌種で一定の割合で発見されています。略語は、各生物のタンパク質の各シリーズに個別に付けられており、名前は通常、タンパク質の機能についてあまり明らかにし異なる細菌で独立して発見されたいくつかのタンパク質は、後に相同であることが示されました。ただし、歴史的な名前はほとんど保持されており、混乱を招く可能性がたとえば、タンパク質SicA、IpgC、およびSycDは、それぞれサルモネラ菌、赤痢菌、およびエルシニアのホモログですが、名前の最後の文字(「シリアル番号」)はそれを示し
以下は、いくつかのT3SS含有種で最も一般的なタンパク質シリーズ名の要約です。これらの名前には、T3SS機構を形成するタンパク質と、分泌されるエフェクタータンパク質が含まれることに注意して
エルシニア
Yop:エルシニアアウタープロテイン
Ysc:エルシニア分泌物(成分)
Ypk:エルシニアプロテインキナーゼ
サルモネラ
スパ:抗原の表面提示
シック:サルモネラ侵入シャペロン
一口:サルモネラ侵入タンパク質
Prg:PhoP抑制遺伝子
Inv:侵略
Org:酸素調節遺伝子
Ssp:サルモネラ菌分泌タンパク質
Iag:侵入関連遺伝子
赤痢菌
Ipg:侵入プラスミド遺伝子
Ipa:侵入プラスミド抗原
Mxi:Ipaの膜発現
スパ:抗原の表面提示
Osp:外側赤痢菌タンパク質
エシェリキア
Tir:転置されたインチミン受容体
9月:大腸菌タンパク質の分泌
Esc:エシェリキア分泌物(成分)
Esp:エシェリヒア分泌タンパク質
Ces:大腸菌分泌のシャペロン
シュードモナス
Hrp:過敏感反応と病原性
Hrc:過敏感反応が保存されている(またはHrpが保存されている)
リゾビウム
Nop:根粒形成タンパク質
Rhc:リゾビウム保存
いくつかの種で:
Vir:病原性 「Protochlamydiaamoebophila」 「Sodalisglossinidius」
これらの略語の後には、文字または数字が続きます。文字は通常、「シリアル番号」を示します。これは、発見の時系列順またはオペロン内の遺伝子の物理的出現順序のいずれかです。まれなケースである数字は、タンパク質の分子量をkDaで示します。例:IpaA、IpaB、IpaC; MxiH、MxiG、MxiM; Spa9、Spa47。
いくつかの重要な要素がすべてのT3SSに現れます:針モノマー、針の内側ロッド、リングタンパク質、2つのトランスロケーター、針先タンパク質、ルーラータンパク質(針の長さを決定すると考えられています;上記を参照)およびATPアーゼの分泌のためのエネルギーを供給し、。次の表は、4つのT3SS含有細菌におけるこれらの重要なタンパク質のいくつかを示しています。
↓機能/属 赤痢菌 サルモネラ エルシニア エシェリキア
ニードルモノマー MxiH PrgI YscF EscF
インナーロッド MxiI PrgJ YscI EscI
針先タンパク質 IpaD SipD LcrV EspA
トランスロケーター IpaB SipB YopB EspD
トランスロケーター IpaC SipC YopD EspB
2つのトランスロケーターのシャペロン IpgC SicA SycD CesD
ATPase Spa47 InvC YscN SepB(EscN)
ルーラータンパク質 Spa32 InvJ YscP Orf16
スイッチ Spa40 スパS YscU EscU
ゲートキーパー MxiC InvE YopN(TyeA) SepL
T3SS研究で採用された方法編集
T3SS針複合体の分離
細胞から大きくて壊れやすい疎水性の膜構造を分離することは、長年の課題を構成してきました。しかし、1990年代の終わりまでに、T3SSNCを分離するためのいくつかのアプローチが開発されました。1998年に、最初のNCがSalmonellatyphimuriumから分離されました。
分離のために、細菌は対数増殖期に達するまで大量の液体増殖培地で増殖します。次に、それらを遠心分離します。上清(培地)を廃棄し、ペレット(細菌)に再懸濁し、溶解緩衝液、典型的に含有するリゾチームと時々洗剤などLDAO又はトリトンX-100。このバッファーは細胞壁を崩壊させます。数回の溶解と洗浄の後、開いたバクテリアは一連の超遠心分離にかけられます。この処理は、大きな高分子構造を強化し、小さな細胞成分を廃棄します。最終溶解物をCsCl 密度勾配によるさらなる精製に供する。
さらに精製するための追加のアプローチは、アフィニティークロマトグラフィーを使用します。タンパク質タグ(たとえば、ヒスチジンタグ)を持つ組換えT3SSタンパク質は、分子クローニングによって生成され、研究対象の細菌に導入(変換)されます。最初のNC分離後、上記のように、溶解物はタグ(ヒスチジンタグの場合:ニッケルイオン)に高い親和性を持つ粒子でコーティングされたカラムを通過します。タグ付けされたタンパク質はカラムに保持され、ニードルコンプレックス全体が保持されます。このような方法を使用すると、高度な純度を実現できます。この純度は、NCの特性評価に使用されてきた多くの繊細なアッセイに不可欠です。
タイプIIIエフェクターは、1990年代の初めから知られていましたが、それらが宿主細胞に送達される方法は完全な謎でした。多くのべん毛とT3SSタンパク質間の相同性により、研究者はべん毛に類似した外側のT3SS構造の存在を疑うようになりました。針の構造の識別とその後の分離により、研究者は次のことが可能になりました。
NCの三次元構造を詳細に特徴づけ、これを通じて分泌のメカニズムに関する結論を導き出します(たとえば、針の幅が狭いと、分泌前にエフェクターを展開する必要があります)、
NCのタンパク質成分を分析します。これは、分離された針をプロテオミクス分析にかけることによって行われます(以下を参照)。
T3SS遺伝子をノックアウトし、変異した細菌からNCを分離し、変異によって引き起こされた変化を調べることにより、さまざまなNCコンポーネントに役割を割り当てます。
顕微鏡学、結晶学および固体NMR
ほとんどすべてのタンパク質と同様に、T3SSNCの視覚化は電子顕微鏡でのみ可能です。NCの最初の画像(1998)は、生きた細菌の細胞壁から突き出た針状構造と、平らな2次元の孤立したNCを示していました。 2001年に、フレキシネル赤痢菌のNCの画像がデジタル分析され、平均化されて、NCの最初の半3D構造が得られました。からNCの螺旋構造フレクスナー赤痢菌は、 16の解像度で解決されたÅ用いてX線 繊維回折2003年、及び年後17-オングストロームからNCの3D構造ネズミチフス菌は、公開されました。最近の進歩とアプローチにより、NCの高解像度3D画像が可能になり 、NCの複雑な構造がさらに明確になりました。
何年にもわたって多くのT3SSタンパク質が結晶化されてきました。これらには、NCの構造タンパク質、エフェクター、シャペロンが含まれます。針状複合体モノマーの最初の構造は、「Burkholderia pseudomallei」のBsaLのNMR構造であり、その後、Shigella flexneriのMixHの結晶構造であり、どちらも2006年に解決されました。
2012年に、組換え野生型針の生産、固体NMR、電子顕微鏡、およびロゼッタモデリングの組み合わせにより、超分子界面、そして最終的にはサルモネラ菌T3SS針の完全な原子構造が明らかになりました。 80残基のPrgIサブユニットは、Salmonella typhimuriumのべん毛と同様に、2ターンあたり約11個のサブユニットを持つ右巻きのらせん状の集合体を形成することが示されました。モデルはまた、高度に保存されたカルボキシ末端が内腔に向かっている間、針の表面に位置する拡張されたアミノ末端ドメインを明らかにした。
プロテオミクス
T3SSを構成するタンパク質の配列を特定するために、いくつかの方法が採用されています。単離された針状複合体は、SDS-PAGEで分離することができます。染色後に現れるバンドは、ゲルから個別に切り出し、タンパク質シーケンシングと質量分析を使用して分析できます。NCの構造成分は互いに分離することができ(たとえば、針の部分と基部の部分)、それらの画分を分析することにより、それぞれに関与するタンパク質を推定することができます。あるいは、分離されたNCは、NCプロテオームの全体像を取得するために、事前の電気泳動なしで、質量分析によって直接分析することができます。
遺伝的および機能的研究
多くのバクテリアのT3SSは研究者によって操作されてきました。個々の操作の影響を観察することで、システムの各コンポーネントの役割についての洞察を引き出すことができます。操作の例は次のとおりです。
1つまたは複数のT3SS遺伝子の削除(遺伝子ノックアウト)。
過剰発現(換言すれば、生産一つ以上のT3SS遺伝子のin vivoでの量でT3SSタンパク質の通常よりも大きいです)。
T3SS遺伝子またはタンパク質の点または領域の変化。これは、タンパク質の特定のアミノ酸または領域の機能を定義するために行われます。
ある種の細菌から別の種への遺伝子またはタンパク質の導入(交差補完アッセイ)。これは、2つのT3SS間の相違点と類似点を確認するために行われます。
T3SSコンポーネントの操作は、細菌の機能と病原性のいくつかの側面に影響を与える可能性が考えられる影響の例:
細胞内病原体の場合、細菌が宿主細胞に侵入する能力。これは、浸潤アッセイ(ゲンタマイシン保護アッセイ)を使用して測定できます。
細胞内細菌が宿主細胞間を移動する能力。
細菌が宿主細胞を殺す能力。これは、いくつかの方法で測定できます。たとえば、LDH放出アッセイでは、死んだ細胞から漏れる酵素LDHを、その酵素活性を測定することで特定します。
特定のタンパク質を分泌する、またはまったく分泌するT3SSの能力。これを分析するために、液体培地で増殖する細菌に分泌が誘導されます。次に、細菌と培地を遠心分離によって分離し、培地画分(上清)を分泌タンパク質の存在についてアッセイします。通常分泌されるタンパク質が分泌されるのを防ぐために、大きな分子を人工的に付着させることができます。分泌されなかったタンパク質が針状複合体の底に「詰まった」ままである場合、分泌は効果的にブロックされます。
無傷の針状複合体を組み立てる細菌の能力。NCは、操作された細菌から分離し、顕微鏡で調べることができます。ただし、小さな変化は顕微鏡で常に検出できるとは限りません。
生きている動物や植物に感染する細菌の能力。操作されたバクテリアがinvitroで宿主細胞に感染できることが示されたとしても、生きている生物の感染を維持するそれらの能力は当然のこととは言えません。
他の遺伝子の発現レベル。これはいくつかの方法で分析できます。特にノーザンブロットとRT-PCRです。全ゲノムの発現レベルは、マイクロアレイによって分析することができます。多くのタイプIII転写因子と調節ネットワークがこれらの方法を使用して発見されました。
バクテリアの成長と適応度。
T3SSの阻害剤
Streptomyces種によって自然に生成されるグアジノミンを含む、グラム陰性菌のT3SSを阻害するいくつかの化合物が発見されました。 T3SSも阻害するモノクローナル抗体が開発されています。 T3SSタンパク質の翻訳を阻害できる抗生物質であるAurodoxは、invitroおよび動物モデルでT3SSエフェクターを予防できることが示されています 。
タイプIIIシグナルペプチド予測ツール
効果的なT3
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参考文献
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Pseudomonas syringaepv。における宿主-病原体相互作用 トマトとトマト植物は細菌の斑点病につながります。”